As doenças genéticas ainda são um desafio global, pois são causadas por mutações em genes que afetam as funções biológicas, processos metabólicos ou produção de certas proteínas essenciais dos indivíduos, até diversas doenças hereditárias. Os medicamentos de terapia gênica são um tipo de intervenção terapêutica que tem como alvo genes específicos, com o objetivo de repará-los ou modificá-los, e fornecer novas instruções para que as células produzam proteínas funcionais ou intervenham nos defeitos genéticos que causam doenças.
Os medicamentos genéticos comuns incluem principalmente DNA e RNA, onde o DNA pode ser fragmentos de genes ou sequências de genes com efeitos terapêuticos. Esse DNA é entregue às células para substituir ou complementar as funções genéticas defeituosas ou ausentes. O RNA pode ser RNA mensageiro (mRNA), pequeno RNA interferente (siRNA) ou oligonucleotídeos antisense (ASO), etc., que podem ser usados para modificar, inibir a expressão de genes prejudiciais ou restaurar a função de genes específicos.
No entanto, tanto o DNA quanto o RNA enfrentam muitos desafios desde a entrada no corpo humano até chegar às células-alvo. Como as sequências genéticas são instáveis no trato gastrointestinal, geralmente são administradas por injeção intravenosa ou subcutânea, mas mesmo assim, a maioria das sequências genéticas ainda é degradada pelas nucleases abundantes no corpo humano.
Quando uma pequena quantidade de medicamentos genéticos residuais atinge o exterior das células-alvo, eles não podem entrar nas células porque as sequências genéticas são moléculas grandes com grupos fosfato carregando cargas negativas, enquanto as membranas celulares também carregam cargas negativas. Quando duas cargas negativas se encontram, os genes são repelidos e não podem entrar nas células. Portanto, precisamos desenvolver métodos específicos de entrega de medicamentos genéticos para prevenir sua degradação in vivo e melhorar a eficiência da penetração da membrana celular, e entregar sequências de DNA ou RNA às células sem problemas.
Métodos de entrega para medicamentos genéticos
Os atuais métodos comuns de entrega de genes são divididos principalmente em duas categorias: entrega de vetores virais e entrega de vetores não{0}}virais. A entrega de vetores virais inclui principalmente vírus adeno{2}}associados (AAV) e lentivírus, etc., que podem simular o processo de infecção viral das células hospedeiras e atravessar facilmente as barreiras celulares, alcançando assim alta eficiência de entrega. No entanto, a entrega do vetor viral também apresenta problemas: primeiro, tem capacidade de empacotamento limitada, como a capacidade máxima de empacotamento do AAV é de 4,7 kb, que não pode entregar sequências genéticas mais longas; em segundo lugar, os vectores virais podem causar reacções imunitárias graves, incluindo imunidade celular e imunidade humoral, apresentando riscos para aplicações clínicas. Comparados a isso, os vetores não{7}}virais apresentam enormes vantagens em termos de segurança e capacidade de carregamento de medicamentos.
Os atuais vetores não{0}virais comumente usados incluem principalmente lipossomas, polímeros, nanopartículas, exossomos, etc., entre os quais lipossomas são vesículas formadas por moléculas anfifílicas com diâmetros variando de 100 nm a 1um. Eles são compostos principalmente de fosfolipídios, colesterol, lipídios PEG e lipídios catiônicos. A estrutura da bicamada fosfolipídica é semelhante às membranas celulares e pode entrar nas células suavemente por meio de endocitose. Além disso, os lipossomas também podem modificar o PEG ou anticorpos específicos nas suas superfícies para escapar da depuração imunológica do corpo enquanto têm como alvo tecidos ou células específicas. Os lipossomas catiônicos são lipossomas que contêm lipídios de sal de amônio quaternário carregados positivamente, que podem se ligar melhor a medicamentos de ácido nucleico carregados negativamente e manter a estabilidade do sistema de entrega. Portanto, os lipossomas são um dos métodos comuns de distribuição de vetores não{9}virais para medicamentos genéticos.
No entanto, os lipossomas tradicionais também apresentam alguns problemas: em primeiro lugar, devido à grande extensão dos diâmetros dos lipossomas, embora isto possa garantir capacidade suficiente de carga de fármaco, quando os lipossomas passam através do espaço endotelial vascular (100-200nm), um tamanho demasiado grande dificultará este processo. Além disso, depois que os lipossomas entram nas células através de endocitose e formam o sistema endossomo-lisossoma, os lipossomas tradicionais não conseguem completar o escape lisossômico a tempo, resultando na degradação da maioria dos medicamentos genéticos pelos lisossomos e incapazes de exercer seus efeitos. Com base nestas deficiências dos lipossomas tradicionais na entrega de medicamentos genéticos, as nanopartículas lipídicas (LNP) foram desenvolvidas e tornaram-se um importante método de entrega, especialmente adequado para a entrega de ácidos nucleicos a células e tecidos alvo.
Introdução ao sistema de transporte LNP
Nanopartículas lipídicas (LNP) são nanopartículas compostas de substâncias-semelhantes a lipídios e com diâmetro geralmente entre 10-200 nm. Em comparação com os lipossomas tradicionais, eles são menores e mais fáceis de passar pelas lacunas endoteliais vasculares. Além disso, o LNP geralmente consiste em lipídios catiônicos/ionizáveis, fosfolipídios auxiliares, lipídios de polietilenoglicol (PEG) e colesterol. Entre eles, os fosfolipídios auxiliares e o colesterol podem aumentar a estabilidade do LNP; Os lipídios PEG ajudam a aumentar o tempo de circulação do LNP in vivo e a reduzir as reações imunológicas. Esses componentes têm funções semelhantes às dos lipossomas tradicionais. A diferença está nos lipídios catiônicos/ionizáveis, que também são a principal área de proteção de patente do LNP.
Como mencionado anteriormente, os lipossomas catiônicos podem efetivamente manter a ligação com medicamentos de ácido nucleico e melhorar a eficiência de distribuição de medicamentos de ácido nucleico. No entanto, os lipossomas catiônicos também são propensos à ligação in-específica com proteínas plasmáticas carregadas negativamente, células sanguíneas, etc. na circulação corporal, causando agregação de lipossomas e sendo rapidamente eliminados do corpo (a meia-vida dos lipossomas catiônicos in vivo é de apenas 15 min).
Para resolver este problema, os pesquisadores desenvolveram um novo tipo de material lipídico chamado lipídios ionizáveis. Os lipídios ionizáveis são muito semelhantes aos lipídios catiônicos em estrutura. Tomando como exemplos o lipídeo catiônico comum DOTAP e o lipídeo ionizável DODAP, a diferença é que o DOTAP é um sal de amônio quaternário com carga positiva, enquanto o DODAP é uma estrutura de amina terciária. A estrutura da amina terciária pode manter o pKa do lipídio entre 6-7. Quando o pH é inferior ao pKa (sob condições ácidas), os lipídios ionizáveis ficam carregados positivamente.
Quando o pH está próximo do pKa (sob condições neutras), os lipídios ionizáveis são neutros. Este projeto pode resolver de forma inteligente o problema encontrado pelos lipossomas catiônicos: como o pH na circulação sanguínea é próximo do neutro, os lipídios ionizáveis também são neutros, e a ligação não{1}}específica entre eles e as proteínas plasmáticas ou células sanguíneas é significativamente reduzida, prolongando a meia-vida. Além disso, quando os lipídios ionizáveis LNP são absorvidos pelas células e entram nos lisossomos, os lipídios são ionizados e carregados positivamente no ambiente lisossômico com pH 5-6. Os lipídios carregados positivamente são facilmente fundidos com a membrana do endossomo-lisossomo, permitindo que os lipossomas escapem para o citoplasma, se dissociem e liberem ácidos nucléicos, exercendo assim seus efeitos. Em resumo, projetar um sistema transportador de LNP envolve otimizar a composição lipídica, tamanho de partícula, carga superficial e estabilidade para alcançar a entrega eficiente de genes.
Estratégia de bioanálise de LCMS para medicamentos genéticos-embalados LNP
Os medicamentos genéticos empacotados-do LNP consistem principalmente no invólucro do LNP e no próprio medicamento genético. O invólucro do LNP consiste principalmente em componentes lipídicos (lipídios catiônicos/ionizáveis representam cerca de 30-50%, lipídios PEG representam cerca de 2%, colesterol é responsável por cerca de 20-50%, fosfolipídios auxiliares representam cerca de 10-20%), enquanto os medicamentos genéticos consistem principalmente em fragmentos de sequência genética (DNA, ASO, siRNA e miRNA, etc.). De acordo com as últimas regulamentações da NMPA e FDA [14-15], para aplicação IND de medicamentos do sistema de entrega de medicamentos, como o LNP, além de realizar estudos farmacológicos e farmacocinéticos sobre o ingrediente ativo (sequência do gene), segurança e avaliação farmacêutica também são necessárias para novos componentes lipídicos que não foram utilizados em medicamentos comercializados no sistema de entrega de medicamentos, como lipídios catiônicos/ionizáveis e lipídios PEG com modificações especiais no LNP.
A bioanálise LCMS de lipídios LNP concentra-se em lipídios catiônicos/ionizáveis e lipídios PEG. Devido às diferenças estruturais entre eles, o peso molecular lipídico catiônico/ionizável está geralmente dentro de 1 kDa, enquanto o peso molecular lipídico PEG pode atingir 2 ~ 5 kDa após transportar grupos de modificação, resultando em grandes diferenças na retenção cromatográfica e na resposta de espectrometria de massa entre eles. Considerando que o teor de lipídeo catiônico/ionizável no LNP é superior ao do lipídeo PEG, a diferença de resposta leva à incapacidade de unificar efetivamente os métodos de pré-tratamento (a seleção do solvente de extração, a determinação do fator de diluição) de ambos. Além disso, devido à presença de muitos picos interferentes em torno da posição do pico do lípido PEG, é frequentemente necessário um gradiente de separação de fase líquida mais longo para uma separação eficaz, o que não pode garantir uma elevada eficiência de análise. Portanto, estabelecemos separadamente o método de detecção lipídica de PEG em bioanálise. Ao mesmo tempo, lipídios catiônicos/ionizáveis e lipídios PEG também apresentam dificuldades comuns no desenvolvimento de métodos devido aos seus componentes lipídicos, como baixa solubilidade em água, instabilidade na matriz biológica, ligação proteica ao limite de recuperação superior, alta interferência e resíduo de lipídios PEG, mudança de estabilidade de lipídios na matriz de amostra real e dificuldade na seleção do padrão interno.
